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《mRNA-LNP疫苗的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性》文獻(xiàn)解讀系列二

更新時(shí)間:2021-08-24   點(diǎn)擊次數(shù):2093次

LNPs 作為遞送系統(tǒng)

為了克服裸露的mRNA轉(zhuǎn)染的種種問題,已經(jīng)開發(fā)了保護(hù)性遞送系統(tǒng)。目前的mRNA疫苗(表 1)都在使用 LNP 技術(shù)。這說明了使用LNP能在穩(wěn)定mRNA 的同時(shí)并將其遞送到細(xì)胞中。mRNA疫苗中的LNP 由四種主要成分組成(見表1):中性磷脂、膽固醇、聚乙二醇 (PEG) 脂質(zhì)和可電離脂質(zhì)。可電離脂質(zhì)含有帶正電荷的可電離胺基團(tuán)(在低 pH 條件下電離),可在顆粒形成過程中與陰離子mRNA 相互作用,并在細(xì)胞攝取過程中促進(jìn)膜融合。此外,PEG化脂質(zhì)用于控制粒徑并充當(dāng)空間屏障起穩(wěn)定作用,防止儲(chǔ)存過程LNP微粒聚集。通過使用微流控混合生產(chǎn)技術(shù),這些脂質(zhì)成分與 mRNA 一起形成大小約為 60-100 nm 的顆粒。例如,SARS-CoV-2 候選疫苗nCoVsaRNA和ARCoV的平均粒徑分別為75 nm和89 nm。


表一:

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LNPs與脂質(zhì)體的不同之處在于微粒核中存在脂質(zhì),來自幾項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明水也存在于微粒內(nèi)部某些空間。這意味著mRNA即使被包封也可能暴露于水性環(huán)境中。這種類型的內(nèi)部結(jié)構(gòu),先前已在未包載和包載siRNA的LNP中被冷凍電鏡所觀察到。類似地,mRNA-LNPs 的冷凍電鏡結(jié)果也顯示了電子致密核,勞氏紫(Thionine)對(duì)RNA進(jìn)行染色用于冷凍電鏡對(duì)比度增強(qiáng)(見圖2)。


盡管mRNA-LNP 的共同特征是脂質(zhì)核,但該核的確切結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)脂質(zhì)成分(摩爾比)和 mRNA 定位的依賴性仍存在爭議(見圖3)。正如 RiboGreen檢測實(shí)驗(yàn)所確定的那樣,mRNA 肯定位于 LNP 內(nèi)部。RiboGreen 是一種染料,當(dāng)與單鏈 mRNA 結(jié)合時(shí)會(huì)顯示熒光,但不能進(jìn)入 LNP。在 mRNA-LNP 制劑中,例如mRNA 疫苗的制劑,可與RiboGreen結(jié)合產(chǎn)生熒光的mRNA 比例非常低,因此,采用RiboGreen來測定的包封率通常 > 90%。綜上所述,冷凍電鏡(圖2) 和包封率證據(jù)表明,mRNA-LNPs形成納米粒子,其中包封了 mRNA,可免受外部介質(zhì)的影響,LNPs包封的mRNA的結(jié)構(gòu)有3種模型,這些主要來源于siRNA-LNPs分析(圖3)。

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圖2 mRNA-LNP 的冷凍電鏡圖像顯示具有明顯不同電子密度的“囊泡"結(jié)構(gòu)

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圖3 siRNA-LNP 和 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)的推測模型的示意圖 A:多層囊泡;B:納米結(jié)構(gòu)核;C:均質(zhì)核殼


mRNA疫苗所包封的mRNA會(huì)影響終LNP的結(jié)構(gòu):siRNA 在結(jié)構(gòu)和分子量大小上與 mRNA 有很大不同(表 2)并且N/P(可電離的陽離子脂質(zhì)與核苷酸磷酸鹽)摩爾比不同,N/P摩爾比分別為3和6(表 1)。mRNA 至少比 siRNA 大 100 倍,這會(huì)影響 LNP 的結(jié)構(gòu)。此外,有跡象表明 mRNA 位于 LNP 的核,而siRNA 更靠近表面,mRNA 可以形成“囊泡"(圖 2)。LNP 囊泡部分的組成是一個(gè)有爭議的問題,在這種狀態(tài)時(shí):“mRNA 可以從帶電的脂質(zhì)中解離,留在充滿溶劑的囊泡隔室中"。


表2  mRNA 和siRNA分子之間的差異

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mRNA-LNP不太可能是(圖 3A)的多層囊泡模型。它與mRNA-LNP的 TEM結(jié)果中電子致密核位置不對(duì)應(yīng)。目前,大多數(shù)研究人員認(rèn)為 mRNA-LNP 貼近核殼模型(圖3 B和C),這意味著納米顆粒具有表面層和無定形的各向同性核。Viger-Gravel等,使用核磁共振光譜證明LNP結(jié)構(gòu)的兩種類型的是可能的。


他們描述了一個(gè)被陽離子脂質(zhì)包圍(圖3B)的包含水孔的無定形核模型。他們還假設(shè)中的脂質(zhì)可以均勻分散,中間有“小水球"(圖 3C)。后者(圖3B和C)跟siRNA-LNPs和mRNA-LNPs在實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果更吻合。


Arteta等人,使用冷凍電鏡、小角 X 射線散射 (SAXS) 和小角度中子散射 (SANS) 測量 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)模型。他們發(fā)現(xiàn)DSPC和PEG化脂質(zhì)以及部分可電離的陽離子脂質(zhì)和膽固醇是位于LNP 的表面,可電離的陽離子脂質(zhì)、膽固醇(取決于其濃度)、水和 mRNA 的主要部分分布在內(nèi)部。有趣的是,他們的研究表明,各向同性LNP 由24%(體積分?jǐn)?shù))的水組成。他們指出 mRNA 位于水柱內(nèi),水柱被陽離子脂質(zhì)包圍(如圖4所示)。這意味著 mRNA 至少部分暴露于LNP 內(nèi)部的水中,這可能導(dǎo)致mRNA在非冷凍條件下儲(chǔ)存時(shí)不穩(wěn)定,Sebastiani等人也報(bào)道了類似的結(jié)果。


因此,研究 mRNA 如何與 LNP 中的水和可電離的陽離子脂質(zhì)相互作用是一件很有趣的事。mRNA 是親水的,它可以通過靜電和氫鍵與可電離的陽離子脂質(zhì)相互作用(通常表觀pKa < 6.5)。這取決于 LNP 內(nèi)部的pH值,如果 LNP 外殼對(duì)質(zhì)子具有滲透性——這很可能,因?yàn)?2-(對(duì)甲苯胺基)-6-萘磺酸 (TNS) 和勞氏紫等離子化染料可以進(jìn)入 LNP ,那么LNP內(nèi)部的pH值與制劑的其余部分應(yīng)該相似,約為7 到 8,這意味著大多數(shù)可電離的陽離子脂質(zhì)將不帶電。


然而,由于可電離的陽離子脂質(zhì)堆積在中,它們可能表現(xiàn)出聚電解質(zhì)行為,導(dǎo)致 Henderson-Hasselbalch 方程的偏差,即滴定曲線的“拖尾"(脂質(zhì)膜內(nèi)的可電離脂質(zhì)的表觀pKa可能與實(shí)際值有較大偏差,這意味著pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在脂質(zhì)膜內(nèi)的表觀pKa可能與理論值有1~2個(gè)pKa單位的偏差,所以pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在pH值為7-8之間的脂膜內(nèi)時(shí),依然有可能絕大部分呈現(xiàn)帶正電的狀態(tài),注:紅色斜體部分是對(duì)一些較復(fù)雜概念的進(jìn)一步解讀,后同)。此外,mRNA 和可電離的陽離子脂質(zhì)之間的相互作用可能會(huì)影響電離行為。


對(duì)于 siRNA,發(fā)現(xiàn)與可電離陽離子脂質(zhì)存在較弱的靜電相互作用,這表明至少對(duì)于 siRNA-LNP 制劑,內(nèi)部的pH值接近或等于外部的pH值。對(duì)于 mRNA-LNP,尚未進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)研究。mRNA 和陽離子脂質(zhì)復(fù)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究證明了脂質(zhì)-脂質(zhì)簇和脂質(zhì)-mRNA 簇的形成。靜電力和氫鍵都在驅(qū)動(dòng)陽離子脂質(zhì)和 mRNA 的相互作用。

圖片6.png

圖4 mRNA-LNPs中mRNA-水柱的示意圖


Arteta 等人的另一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)是他們的mRNA-LNP 的外殼是單層的。其他研究人員根據(jù)冷凍電鏡(圖 2)或 SANS結(jié)果分析提出,mRNA-LNPs 的外殼由一個(gè)或多個(gè)雙層組成。這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)表明,使用這些技術(shù)評(píng)估m(xù)RNA-LNP 殼的性質(zhì)是困難的,可能存在多種類型的mRNA-LNP 結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)取決于脂質(zhì)的性質(zhì)和mRNA-LNP 的制備方法。反過來,不同的結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)不同配方的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。總之,問題仍然在于目前我們尚不清楚 mRNA-LNP 的結(jié)構(gòu)以及包封的mRNA 與各種脂質(zhì)成分之間的相互作用。


對(duì)各種 mRNA疫苗成分的分析表明,它們具有共同特征,但也存在差異(表 1)。LNP 配方、修飾核苷的使用、高GC含量以及常規(guī) mRNA 和 SAM 疫苗之間的長度差異可能會(huì)影響這些 mRNA疫苗在儲(chǔ)存過程中的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。




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