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凡人修煉脂質體秘籍5----制備工藝篇

更新時間:2022-02-23   點擊次數:3535次

前面幾篇已對脂質體的文獻查閱,處方輔料等做了大量的描述,本篇對脂質體的制備工藝做專門的介紹。藥物包封率、無菌性、藥物保留性、制備方法和可否規模化生產,脂質體穩定性和成本及有效性都取決于脂質體中載藥方法的選擇。脂質體制備工藝的區別在于脂質從有機溶劑中干燥或分離然后再分散在水性介質中的方式。脂質體的主要制備工藝可分為主動載藥法和被動載藥法兩種。被動載藥法包括薄膜分散法、逆向蒸發法、二次乳化法、溶劑注入法、冷凍干燥法、熔融法去污劑除去法等。主動載藥法包括PH值梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法、離子載體法等。


1. *發布的指南文章對脂質體工藝要求

1.1國外有2015年 FDA Liposome Drug Products脂質體藥物制藥工業指南草案。

建議附上詳細的工藝流程圖和各操作點工藝監控參數變化范圍及過程控制的描述。這些變化范圍應基于藥學開發的研究結果。

1.2國內在 2020-11-30 頒布了鹽酸多柔比星脂質體注射液仿制藥研究技術指導原則(試行)。

采用硫酸銨梯度法制備的主要步驟包括:1)空白脂質體的制備,2)硫酸銨梯度的形成,3)活性藥物的裝載。活性藥物的裝載是多柔比星在脂質體內外相的硫酸銨濃度梯度驅動下擴散到空白脂質體內完成的。應提供詳細的生產工藝開發研究資料和工藝驗證資料(包括無菌工藝驗證資料)。建議制定合理的生產過程控制策略,如關鍵步驟的生產時限、關鍵中間體的質量控制標準和保持時限等。應特別關注生產工藝和批量對產品質量可控性的影響,注冊批和商業批的生產工藝及批量原則上應保持一致。

1.3中國藥審中心:2005年10月20日細胞毒類抗腫瘤藥脂質體制劑專題會會議紀要 。

目前報道的制備方法(如高壓乳勻過濾法、注入法、旋轉成膜水化法)均有工藝放大的可行性,但在研究的初期,就需關注工業化大生產需配套的儀器設備以及關鍵工藝環節的研究。根據目前的研究經驗,對于旋轉成膜水化后的產品,一般都不是很均勻,都需要經過勻質化處理(如超聲,高壓乳勻)。 

1.4中國藥審中心關于脂質體、乳劑注冊申報注意事項文章:審評三部 張寧  注冊分類五中的特殊情況。

對于制劑而言,處方工藝篩選是整個研究過程中的前期工作和重點工作,建議申辦者能供詳盡的處方工藝篩選過程,并附有翔實的試驗數據和結果分析。如上資料,從申報者的角度考慮,是對最終確定的處方工藝的合理性進行充分的闡述,從審評者的角度考慮,這是評價的基礎。其中,需提醒重點關注的是關于滅菌工藝的選擇和驗證,如上制劑由于輔料的不穩定性(例如磷脂易氧化降解)、劑型的不穩定性(例如乳劑的分層問題)等,導致滅菌工藝的選擇比較困難,故提請申辦單位對最終選擇的滅菌工藝進行驗證,證明所用滅菌工藝既能保證產品達到無菌效果,又不影響產品質量。

1.5中國藥審中心2004年11月11日兩個腫瘤藥物脂質體品種的專家咨詢會。

處方工藝的篩選指標應全面,需綜合考慮包封率、滲漏率、粒徑、穩定性(包括產品的穩定性和脂質材料的穩定性)等因素。對于關鍵的工藝條件和工藝步驟應進行驗證,說明工藝的合理性和重現性。對所用的工藝設備應給予明確說明,并對放大生產的可行性進行論證。

1.6 CFDA 發布《藥物注射劑研發技術指導意見》征求意見稿2018年

滅菌/無菌生產工藝是注射劑的關鍵工藝步驟,須依據滅菌決策樹選擇合理的滅菌/無菌生產工藝,對滅菌/無菌工藝進行驗證,并提供在擬定的工業生產規模生產線進行的工藝驗證方案和報告。關注特殊類型注射劑生產過程中影響制劑特性的工藝因素,對生產工藝進行驗證,并提供在擬定的商業化生產線進行的工藝驗證方案和報告。申報上市的注冊批應該確實保證產品和工藝過程具有工業生產規模下的可行性,并提供驗證資料。對特殊類型注射劑,注冊批生產規模一般至少是工業生產規模的五分之一或至少生產1000支/瓶,兩者中選較大者。對工業生產規模少于1000支/瓶的特殊品種,注冊批生產規模應與工業生產規模一致。


2. 被動與主動載藥工藝

藥物加入脂質體有兩種工藝。被動載藥,藥物在制備過程中被包封在脂質體里。主動載藥,藥物裝載到完整的脂質體中。

2.1被動載藥工藝

能否采用被動載藥工藝,取決于脂質體在形成期間包封特定體積水相的能力,一般在水相中含有溶解的藥物。親水藥物,經被動載藥脂質體包封率與脂質體所在的水相體積有關,脂質體本身性質取決于分散體系的磷脂濃度、層室數和脂質體形態。親脂性藥物與磷脂雙層有相互作用,包封率取決于磷脂類別及其濃度。形態學參數不影響藥物包封率。使用被動載藥技術,水溶性藥物被包裹在脂質體的水相內,而脂溶性藥物被包裹在脂質相中。藥物脂溶性部分將嵌入脂質體磷脂之間,而它們的水溶性部分位于脂質體水相中,從而被包封。

2.2主動載藥工藝

主動載藥是將已經制備的空白脂質體與藥物濃溶液混合,孵育后,藥物擴散均勻分布在脂質體中。磷脂層對藥物擴散具有高度滲透性,能獲得較高包封率。由于濃度梯度,藥物可通過脂質雙層滲透到脂質體中,直到周圍介質和脂質體內部之間達到平衡。主動載藥,水溶性藥物無法進入脂質體內部。能夠進入脂質體的疏水性藥物的量,取決于脂質雙層的空間限制程度。對于兩親性藥物的情況,它們難以保留在脂質體內,因為它們可以快速滲透脂質雙層。主動載藥的缺點在于它僅限一小部分表現為兩性弱堿性或酸性的藥物,只能在不帶電的情況下滲透雙層,而不能在帶電的情況下滲透。


3.比較常用的制備工藝:

3.1溶劑注入法

溶劑注入法是比較常用的一種制備脂質體的方法,一般可將膜材分散在乙醇或Y醚中,再將溶液注入藥物的水溶液中,揮盡溶劑后再勻化或超聲就可得到脂質體。所得脂質體囊泡的平均直徑與磷脂的性質、脂質與藥物的比例,以及水相和有機溶劑組成有關。此方法相比于其他方法可以避免使用氯仿等有毒溶劑,并且以安全價廉的乙醇作為溶劑也更有利于大規模推廣。但是該法目前也還存在溶劑殘留難去除的問題。有人認為醚注入法優于乙醇注入法。

3.1.1乙醇注入法

含脂質的乙醇溶液快速注入過量的水相中。注入力須足以使溶液*混合。乙醇在水相中被稀釋,使得脂質在水相中均勻分散。能制備小單層脂質體囊泡。此外,該方法簡單易行,適用于敏感脂質,因為它可以防止其降解。缺點是磷脂在乙醇中溶解度有限同時脂質膜中乙醇不易*除去。

3.1.2醚注入法

將與脂質混溶的Y醚緩慢注入水相中,在一定溫度下Y醚緩慢蒸發,導致醚與水的梯度延伸到界面脂質單層膜的兩側,形成的雙層膜,折疊形成封閉的囊泡。此法能產生大的脂質體囊泡。醚注入法可避免了敏感的磷脂被氧化降解。缺點是單批脂質體所需的時間較長及需要小心控制脂質溶液的加入。

3.2薄膜分散法

薄膜分散法是將藥物溶于有機溶劑后,減壓除去溶劑,使脂質在容器壁上形成薄膜,再加入含有水溶性藥物的緩沖溶液,充分振搖后得到脂質體。但是此法要使用大量的有機溶劑,耗時長。該法分散的磷脂會在水性緩沖液中產生形狀和尺寸較大(直徑為1-5μm)的多層脂質體。因此,需要使用超聲處理或通過聚碳酸酯濾器的技術,來降低脂質體尺寸,產生尺寸更小、更均勻的脂質體。它的缺點是大多數水溶性化合物在溶脹過程中會被洗除,因此,只有10%-15%的水溶性物質可被包封。國內王溪淼用薄膜分散法制備卡培他濱與奧沙利鉑復方脂質體。邢宇等用薄膜分散超聲法制備銀杏內酯B脂質體。

3.3逆向蒸發法

將膜材的有機溶液與藥物水溶液超聲形成W/O型乳液,再減壓蒸發,就可得到脂質體。此法適用于水溶性藥物和大分子活性物質。將磷脂與有機溶劑一起加入圓底燒瓶中。使用旋轉蒸發儀在減壓和控制溫度條件下,通過蒸發除去溶劑。用氮氣吹掃,并將脂質重新溶解在有機相中。異丙醚和二Y醚是這種脂質體制備方法的溶劑。在重新溶解脂質后,獲得乳液。在減壓下從乳液中除去有機溶劑后形成半固體凝膠。除去游離的或未包封的藥物,獲得的脂質體稱為逆相蒸發脂質體。該法制備的脂質體藥物的包封率較高。

3.4冷凍干燥法

冷凍干燥的方法可用于制備無菌和無熱原的亞微米小尺寸脂質體。將磷脂/膽固醇溶解于適宜的有機溶劑中,常用的是叔丁醇,之后冷凍干燥得到疏松的粉末,將之水化后,則可以得到脂質體。得到的脂質體仍為納米級的不均勻的脂質體。如需要,可以采取前述部分的方法,對其進行后處理。此種方法可以產業化,并且使用的叔丁醇毒性和乙醇相似,無安全問題。凍干制劑臨床使用前進行超聲處理。例如張曉云等人采用有機溶劑凍干法制得鬼臼毒素凍干脂質體,包封率達到93.72%。羅霄等人采用有機溶劑凍干法制備燈盞花素脂質體,制備3批脂質體,包封率平均為87.5%。

3.5超臨界流體法

將壓縮二氧化碳氣體、有機助溶劑和脂質放入溫度高于脂質轉變溫度的攪拌反應釜中,然后緩緩注入水相。當釋放壓縮氣體降低壓力時,形成脂質體。改良的超臨界流體逆相蒸發技術可提高了載藥效率和脂質體的穩定性。

已有報道采用亞臨界或臨界或超臨界的二氧化碳作為溶劑生產脂質體的方法和專用設備。將脂質體的原料混合,如磷脂、膽固醇、脂溶性活性成份等混合后加入到可封閉的罐中,再向罐中加入CO2,并使罐中溫度和壓力達到亞臨界或臨界或超過CO2的臨界溫度和壓力,溶解脂質體的原料后釋放罐中的CO2,使罐中壓力降低至略高于常壓。向罐中加入分散液,浸泡或攪拌形成包裹有脂溶性活性成份的脂質體。

3.6 pH值梯度法

首先根據藥物的性質選擇內向緩沖液和外向緩沖液。如果藥物為生物堿,則內向緩沖液則應為酸性緩沖液,外相緩沖液的pH值應接近生理pH值。通常使用的酸性緩沖液應為多元有機酸,如枸櫞酸、酒石酸等;要求藥物能夠和有機酸根復合形成膠態沉淀。而外相緩沖液則應可以很好的溶解待包封藥物,并且其pH能夠保證絕大多數藥物以非離解的形式存在,以便在加熱孵育的過程中可以有效地穿透磷脂雙分子層。篩選合適的內外相緩沖液的組合是非常重要的,因為它直接決定了藥物在儲存期內的穩定性和藥物在體內的釋放行為。確定內外相緩沖液后,就可以制備空白脂質體

篩選合適的內外相緩沖液的組合是重要的,因為它直接決定了藥物在儲存期內的穩定性和藥物在體內的釋放行為。

硫酸銨梯度是pH梯度常用的一種。以硫酸銨緩沖液為介質制備空白脂質體,經過透析后,在內外水相產生硫酸銨梯度,當脂質體雙分子膜內的硫酸銨濃度遠遠大于外水相中的硫酸銨濃度時,內水相中的銨離子解離,從而使內水相pH降低,建立pH梯度。弱堿性藥物以分子狀態進入內水相,并在酸性條件下成鹽,無法穿過磷脂雙分子層返回外水相。藥物成鹽消耗掉內水相中的氫離子,從而使內水相pH增加,繼續產生游離的氨分子。氨分子跨膜外逸形成pH梯度。上述過程不斷進行直至內水相中氨離子消失,達到電化學平衡狀態。與普通的pH梯度法相比,硫酸銨梯度法脂質體不易因外界pH的改變而泄露,被包裹入脂質體內水相的藥物一般為弱堿性,可與硫酸根形成具有更低溶解性的鹽,在脂質體內部聚集,使其比普通pH梯度法更加穩定,包封率更高。藥物包封主要取決于內水相與外水相中硫酸銨濃度的比值。王紹寧等人分別采用薄膜分散法、逆相蒸發法、乙醇注入法和硫酸銨梯度法制備鹽酸環丙沙星脂質體,結果表明硫酸銨梯度法制備脂質體的包封率(>90 %),明顯高于前3種方法制備得脂質體(<40 %)。國外多柔比星脂質體注射液(Doxil, 1995)采用硫酸銨梯度法制備工藝。

蔗糖八硫酸鹽梯度載藥法近期也有一些報道。2015年上市的伊立替康脂質體Onivyde®,即采用蔗糖八硫酸鹽梯度載藥,使得伊立替康在弱酸性內水相中以沉淀形式被穩定包載。Onivyde®所用磷脂輔料DSPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000以及蔗糖八硫酸酯鹽,中國艾偉拓公司均完成/計劃完成CDE和DMF登記。

此外制備脂質體的工藝還有復乳法、熔融法、表面活性劑處理法、離心法、前體脂質體法、鈣融合法、加壓擠出法、微射流法、膜接觸器法、微流控,高壓均質法等。


4.近期國內脂質體研究制備工藝

目前國內報道的脂質體制備工藝已薄膜分散法為多,還有逆向蒸發法,載體沉積法和冷凍干燥法等。

例如,嵇晶等用逆向蒸發法制備丹參總酚酸復合磷脂脂質體。張璐等用薄膜分散法制備紫杉醇五味子乙素脂質體。呂佳佳等用薄膜分散超聲法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質體。周婷等用薄膜分散法制備羥基喜樹堿脂質體。張麗用薄膜分散法并冷凍干燥制備卡巴他賽脂質體。沈貝莉莎用薄膜水化法并凍干制備紫杉醇脂質體。方曉旭等用冷凍干燥法制備硬脂醇半乳糖苷修飾的阿西替尼脂質體。隋琳等以載體為甘露醇,用載體沉積法制備兩性霉素前體脂質體。


經過幾十年的發展,脂質體制備工藝的研究已經取得很大的進步,切向流過濾法,薄膜分散法、逆相蒸發法、注入法、超聲波分散法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法及其他離子梯度法的相繼問世拓展了脂質體工藝新思路。脂質體屬于*靠工藝控制藥品質量的產品;關鍵工藝步驟:如乳化工藝、溶劑去除工藝、載藥工藝、過濾工藝等關鍵步驟最好全部自動化操作,杜絕人為因素引起的工藝偏差。相信隨著制備工藝設備和條件的日益成熟,脂質體制備工藝水平將會有更廣闊的發展空間。



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